柑橘苗脱毒技术与品种

脱除病毒的几种方式：有热治疗、茎尖培养、茎尖嫁接、热处理+茎尖嫁接等，目前常用的是茎尖嫁接和热处理+茎尖嫁接方式。

脱除病毒的一般步骤：带毒接穗或植株准备、脱毒处理得到新的接穗或植株、通过再鉴定确认已脱毒。

热治疗脱毒技术：将待脱毒植株或接穗放置于高温环境下处理，并维持一段时间进行脱毒的技术。

茎尖嫁接的概念：将嫩梢的生长点连同2-3个叶原基（即大小约0.14―0.18mm的茎尖）嫁接于试管内生长的砧木上的过程。

茎尖嫁接脱除柑橘病毒技术的由来：果树在长期的无性繁殖过程中常感染一种或多种病毒、类病毒和类菌原体等病原微生物。为防止这些病害的蔓延危害，需要使用无病毒繁殖材料。柑桔类果树曾用多胚性种子播种得到无病的珠心系植株。但进入结果期迟，枝条多刺，果实品质不够一致。用温热疗法不能消除耐高温的类病毒病害。根据一般植物生长点不带病毒和通过茎尖培养可以获得无病毒植株的经验，柑桔果树曾试用茎尖培养脱毒，但培养后未能分化成完整植株。美国，Murashige等在1972年改用茎尖嫁接的方法得到少数植株，经鉴定其中部分植株的裂皮病（类病毒）已经脱除。Navarro等在1975年详细研究了诸多因子对茎尖嫁接成活率及脱毒率的影响，建立了常规的操作方法。

茎尖嫁接操作中需要的器材：超净工作台、高压消毒锅、恒温箱、光照培养箱、高倍体视显微镜、酒精灯、镊子（长25cm 及10cm各1把）、茎尖嫁接刀（自制，用宽约6mm的竹片顶端夹住双面刀片的尖头碎片，用棉线捆牢）、试管（口径25mm，长150mm）及棉塞、培养皿（直径10.5cm及6.5cm）和烧杯等。

茎尖嫁接的基本步骤与要点：包括砧木准备、茎尖准备、茎尖嫁接和嫁接苗管理，要求在无菌条件下进行茎尖嫁接操作。

柑橘茎尖嫁接用试管砧木种类的选择：为易于区分试管苗上的茎尖芽和砧木上发出的萌蘖芽，一般用三出叶的枳或枳橙作试管砧木，枳橙因生长快和生长势强而被更多地采用。

茎尖嫁接用试管砧木种子的处理：剥去外、内种皮，用含有0.5%次氯酸钠加湿润剂0.1%吐温20的水溶液消毒十分钟，以灭菌蒸馏水洗3次。

茎尖嫁接用试管砧木的培养：将消毒处理过的种子播种于加有1.2%琼脂的MS植物细胞培养基上，27℃恒温黑暗条件下培养约两周。

茎尖嫁接用试管砧木：

茎尖的准备：采田间或温室生长植株1-3厘米长的嫩梢，去较大叶片，切下尖端1厘米长的梢段，用0.25%次氯酸钠加湿润剂0.1%吐温20的水溶液消毒五分钟，以灭菌蒸馏水洗3次，备用。

嫩梢（带茎尖）消毒：

茎尖嫁接操作：在无菌条件下从试管中取出2周龄砧木，截顶留1.5厘米茎，切去根尖留4-6厘米。去子叶和腋芽。在放大十倍的双筒解剖镜下操作，在顶侧倒“T”形切口，横切一刀，竖切平行两刀，两刀间距以能放入茎尖为宜，深达形成层，挑去三刀间的皮层，形成U字形切。另取消毒好的梢段，用解剖刀将下部叶剥掉，切下生长点连带2-3个叶原基的茎尖，放入切口，切面朝下与砧木的横切面相贴。

显微镜下的茎尖嫁接：

砧木开口和剥取茎尖：

放置茎尖于砧木切口中：

茎尖嫁接苗培养：将茎尖嫁接苗放入盛有液体培养基的试管内（管内事先放入支撑试管苗的折叠滤纸平台，中央打孔，以便插入苗根），置27℃恒温、每天16小时1000勒克司光照条件下培养。

将嫁接好的茎尖苗放入试管培养基中培养：

试管茎尖苗在光照培养箱中生长：

长出真叶的试管茎尖苗：

试管茎尖苗的移栽：茎尖苗培养3-6周，至少长出2片长半厘米以上的叶后移栽，移栽前如能在10000勒克司的强光下连续照两周，可使植株强健。移栽用土壤要适于柑桔生长并经高温消毒。移栽后用聚乙烯薄膜袋套住盆口，捆住保湿，两周后去袋。为避免移栽小苗易因污染而死亡并加速生长，亦可直接把试管茎尖苗再嫁接在盆栽的粗壮砧木上。

试管茎尖苗的再嫁接：待试管内茎尖嫁接苗长出2-3个叶片稍老化时，将茎尖嫁接苗从试管内取出，切去根部，留长1-1.5cm砧木的茎，削去一侧皮层，嫁接在网室内盆栽砧木倒砧口下侧顶部。上套聚乙烯薄膜袋保湿，成活后去袋，待再发新梢老化后截砧。

再嫁接成功的茎尖苗：

茎尖嫁接方法的多种用途：世界各国在柑桔品种改良计划中都用茎尖嫁接方法获得无病植株用作母树，并通过商业苗圃扩大繁殖。此外，茎尖嫁接亦可用于植物检疫和品种采集。将引入的接穗嫁接在温室的粗壮砧木上，或作离体培养促发嫩芽，取芽作茎尖嫁接，其余材料销毁，以减少柑桔植株或接穗带病的危险。利用各种病原对茎尖分生组织部位侵染能力的差异，用茎尖嫁接方法结合温热处理、机械接种及昆虫传病法，可在混合感染中分离得到单一的病原微生物。

热处理+茎尖嫁接脱毒技术：供脱毒的植株每天在40℃有光照条件下生长16 h和在30℃黑暗条件下生长8 h，连续10-60 d后，采嫩梢1-2cm进行茎尖嫁接。

已知茎尖嫁接方法单用或结合热处理可脱除的柑桔病害种类：有黄龙病、裂皮病、木质陷孔病、顽固病、衰退病、苗黄型衰退病、柑桔杂色花叶病、碎叶病、温州蜜柑萎缩病等多种柑桔病害。

柑橘黄龙病的脱毒方法：可应用湿热空气处理脱除柑桔黄龙病，具体方法可参见国家标准GB 5040《柑桔苗木产地检疫规程》相关内容，同时可采用茎尖嫁接脱毒的方式脱除。

柑橘裂皮病的脱毒方法：只可采用茎尖嫁接脱毒的方式脱除，不能采用热治疗方式。

柑橘衰退病的脱毒方法：可用热治疗或热处理+茎尖嫁接脱毒的方式脱除，单用茎尖嫁接脱毒的效果不好。

柑橘碎叶病的脱毒方法：只可采用热处理+茎尖嫁接脱毒的方式脱除，单用热治疗或茎尖嫁接脱毒的效果均不理想。

柑橘温州蜜柑萎缩病的脱毒方法：一般采用热处理+茎尖嫁接脱毒的方式脱除。

柑橘鳞皮病的脱毒方法：一般采用热处理+茎尖嫁接脱毒的方式脱除。

脱毒效果检测：采用指示植物或结合生物化学与分子生物学方法进行检测。

脱毒质量要求：经湿热空气处理、茎尖嫁接或热处理+茎尖嫁接脱毒处理所得苗木，每株均需经检测，用指示植物检测不显症状者或用生物化学和分子生物学方法检测呈阴性者为合格；用指示植物检测有症状者或用生物化学和分子生物学方法检测呈阳性者为不合格。

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